人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展

*代 培養(yǎng)基+牛血清

第二代 培養(yǎng)基+牛血清替代品：人血清、血小板裂解液和臍帶血清

第三代 無血清、無動(dòng)物源、成分確定的培養(yǎng)基

第三代人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基不含牛血清或人血清之類的血清替代品，無動(dòng)物源而且成分確定，免除了異種血清帶來的病原體污染風(fēng)險(xiǎn)，而且批次穩(wěn)定，適合干細(xì)胞治療的臨床研究。

一 知網(wǎng)

搜索方法

使用題名“臍帶”、“間充質(zhì)干細(xì)胞”和“培養(yǎng)”，摘要“無血清”在中國(guó)知網(wǎng)的搜索結(jié)果。

結(jié)論匯總

二 Pubmed

搜索方法

使用(Umbilical Cord[Title] AND Mesenchymal Stem Cells[Title]) AND serum free[Title/Abstract] 在Pubmed的搜索結(jié)果

結(jié)論匯總

三 人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品

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HY StemCell 人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基

HY StemCell CCGmHum^TM 人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基是成分確定、無血清、無動(dòng)物源，無需鋪板膠的*培養(yǎng)基。適用臍帶或脂肪來源的人間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)擴(kuò)增。培養(yǎng)的hMSC可傳多代。HY STEMCELL CCGmHuM^TM 人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基包括【Basal Medium 基礎(chǔ)培養(yǎng)基】 和 【Supplement Medium 細(xì)胞因子添加物】?jī)刹糠?。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加Hepes和L-谷氨酰胺。細(xì)胞因子添加物中含有多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粘附蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、微量元素和人白蛋白等成分。

HY StemCell 人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基現(xiàn)貨供應(yīng)

StemCell 人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基

StemCell MesenCult™-XF 人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基適用人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，是無動(dòng)物源無血清的標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)基。MesenCult™-XF MSC培養(yǎng)基優(yōu)化用于間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增以及CFU-F分析計(jì)數(shù)。支持MSCs的長(zhǎng)期生長(zhǎng)，同時(shí)維持細(xì)胞多系分化潛能。

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參考文獻(xiàn)

一 知網(wǎng)

[1] 趙艷坤,邵偉,雒誠(chéng)龍,余雄.無血清共培養(yǎng)條件下臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用（英文）[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2017,25(04):391-398.

[2] 屈玟,宋磊,趙瑤,胡振波.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不同培養(yǎng)方案的比較與優(yōu)化[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2017,23(08):1009-1013.

[3]孫亞如,張炳強(qiáng),王福斌,許評(píng),王二樸,李翠翠.培養(yǎng)體系對(duì)維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞特性及其體外擴(kuò)增效率的影響[J].中國(guó)組織工程研究,2017,21(13):2023-2028.

摘要：背景:前期數(shù)據(jù)顯示,應(yīng)用人血小板裂解液培養(yǎng)體系對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí),較無血清培養(yǎng)體系能更好地維持干細(xì)胞特性,而無血清培養(yǎng)體系相較于人血小板裂解液培養(yǎng)體系能一定程度上提高間充質(zhì)干細(xì)胞的體外增殖能力。目的:篩選能zui大限度維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞特性及擴(kuò)增效率高的培養(yǎng)體系。方法:將6份人臍帶標(biāo)本分別接種于6種培養(yǎng)體系中,進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng),6種培養(yǎng)體系分別為MesenC ult無血清*培養(yǎng)基中添加2%人血小板裂解液(A組)、StemP ro無血清*培養(yǎng)基中添加2%人血小板裂解液(B組)、MesenC ult無血清*培養(yǎng)基(C組)、Stem Pro無血清*培養(yǎng)基(D組)、低糖DMEM中添加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(E組)、低糖DMEM中添加10%人血小板裂解液(F組),14 d后進(jìn)行消化傳代培養(yǎng),比較各培養(yǎng)體系對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)記物、分化及增殖能力的影響。結(jié)果與結(jié)論:(1)D組第3代細(xì)胞細(xì)長(zhǎng),大小不均;E、F組第3代細(xì)胞扁平,其余組第3代細(xì)胞為長(zhǎng)梭形且大小較均一。A、B組第5代細(xì)胞形態(tài)及大小較第3代時(shí)無明顯變化,C組第5代細(xì)胞趨于扁平且大小不均一,D組第5代細(xì)胞形態(tài)較第3代時(shí)細(xì)長(zhǎng),E組第5代細(xì)胞形態(tài)較第3代時(shí)扁平,F組第5代細(xì)胞形態(tài)較第3代時(shí)無明顯變化;(2)各組細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果無明顯區(qū)別;(3)A、B組成脂、成骨誘導(dǎo)率較高,E、F組次之,C、D組zui低;(4)A組各代次細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量顯著高于C組,B組各代次細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量顯著高于D組,E、F組擴(kuò)增數(shù)量顯著低于培養(yǎng)組A、B組;(5)結(jié)果表明,無血清和人血小板裂解液相結(jié)合的培養(yǎng)基能較好地維持間充質(zhì)干細(xì)胞的特性及擴(kuò)增效率

[4]劉宇,馬明,侯俊,高雪華,陳思翔,劉月,鄧銀,鄭東明,田奕,張蓉,陳靜嫻.體外培養(yǎng)傳代人脂肪、臍帶、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳特性比較研究[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2015,37(12):1616-1622.

摘要：該文利用無血清培養(yǎng)基對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placenta derived mesenchymal stem cells,PMSCs)進(jìn)行了體外傳代培養(yǎng),通過比較此三種不同來源間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及遺傳特性在傳代過程中的變化及差異,為間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性及細(xì)胞來源的選擇提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。通過細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞周期檢測(cè)、表面標(biāo)記物檢測(cè)、染色體核型分析、相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)胞因子的定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),UC-MSCs和ADMSCs在體外培養(yǎng)時(shí)呈長(zhǎng)梭形旋渦狀貼壁生長(zhǎng),而PMSCs則呈短梭形旋渦狀或網(wǎng)狀貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞核較大。通過長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)及細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),PMSCs增殖活性zui強(qiáng),UC-MSCs次之,AD-MSCszui弱。三種細(xì)胞均表達(dá)CD73、CD90和CD105,且陽(yáng)性率大于98%;均低表達(dá)CD11b、CD19、CD34和CD45,且陽(yáng)性率低于1%;HLA-DR均為陰性。三種細(xì)胞染色體核型穩(wěn)定,沒有缺失、易位和倒位等現(xiàn)象。7種基因表達(dá)均有差異,但在7代內(nèi)各基因表達(dá)量?jī)H有微小變化,細(xì)胞因子在傳代過程中均比較穩(wěn)定。以上結(jié)果提示,利用無血清培養(yǎng)基體外傳代培養(yǎng)至7代以內(nèi),PMSCs比AD-MSCs和UCMSCs更安全。

[5]吳潔瑩,陸琰,陳勁松,吳韶清,湯雪薇,李焱.臍帶血血漿分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及體外擴(kuò)增人臍血CD34~+細(xì)胞的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2015,23(04):1112-1119.

[6]任春紅,張昕.無動(dòng)物源成分培養(yǎng)基用于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的研究[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2015,13(01):1-4.

摘要：目的建立一種無動(dòng)物源成份無血清的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基XF/SF-MSCM,并探討其支持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(h UC-MSCs)體外增殖、維持分化潛能的效果。方法組織塊貼壁法分離獲得原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,P1代起分別使用自制的XF/SF-MSCM培養(yǎng)基與含10%胎牛血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基(SC-MSCM)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)傳代至P6代,觀察比較兩組P6代細(xì)胞的形態(tài)及增殖能力,以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)連續(xù)傳代后細(xì)胞的免疫學(xué)表型,比較其成骨、成脂肪的分化潛能。結(jié)果分離獲得的原代P0臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,分別在XF/SFMSCM與SC-MSCM兩種培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)傳代,細(xì)胞增殖能力及形態(tài)無顯著差別。兩組P6代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線相似,但XF/SF-MSCM組間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁的緊密程度稍低;流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示,XF/SF-MSCM組細(xì)胞保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫學(xué)表型,高表達(dá)CD29、CD44、CD90,不表達(dá)CD31、CD34、CD45并維持了良好的成骨和脂肪細(xì)胞的分化能力。結(jié)論本室制備的無動(dòng)物源成份無血清培養(yǎng)基XF/SF-MSCM可支持臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增,維持其免疫學(xué)表型及分化潛能,提供數(shù)量充足的高質(zhì)量間充質(zhì)干細(xì)胞,滿足臨床治療及生物醫(yī)學(xué)研究的需要。

[7]陳林,張坤,董偉,楊珂,艾輝,陳祿華.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清和含胎牛血清培養(yǎng)體系比較[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)),2014,28(09):57-61+86.

摘要：為了比較在無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力、生物學(xué)特性、分化潛能,將臍帶華通氏膠剝出剪碎,分別在無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,并繪制生長(zhǎng)曲線;在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察;利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定其表面標(biāo)記CD73,CD90,CD105,CD14,CD34,CD45,CD79a及HLA-DR的表達(dá);將成骨及成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)1~2周后觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,用堿性磷酸酶染色鑒定其成骨情況,油紅O染色鑒定其成脂情況。結(jié)果表明:無血清與含胎牛血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、表面標(biāo)記和分化潛能相似;但在無血清培養(yǎng)基成分中無動(dòng)物源蛋白引入,是更理想的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基種類。

[8]鄧福珠,畢曉云,何蓉,黃舒,陳晶礪,陳嘉榆,王恒湘,郭子寬.無血清培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療乙型肝炎肝硬化的臨床觀察[J].組織工程與重建外科雜志,2014,10(03):141-144+167.

[9]周平,李丹,陳廣華,王易.無血清培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2013,21(05):1256-1260.

摘要：本研究觀察無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC),并比較與含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的異同。采集正常足月剖宮產(chǎn)胎兒臍帶,用MesenCult-XF無血清培養(yǎng)液或含10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。觀察不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞的形態(tài)、免疫表型、細(xì)胞周期、增殖分化潛能及對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明,采用無血清MesenCult-XF培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC平均傳代倍增6.57±0.7倍,含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC平均傳代倍增4,59±0.45倍(P<0.05);兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC均表達(dá)CD44、CD90、CD73、CD105抗原,不表達(dá)CD31、CD45、HLA-DR及CD34等抗原,表達(dá)程度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC(65±5.2)%均為G o/G1期細(xì)胞,含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC(62±3.1)%為G o/G1期細(xì)胞(P>0.05);兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍帶MSC均可向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化;無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的臍帶MSC按1 000、5 000、10 000、20 000個(gè)細(xì)胞/孔接種密度與反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞共培養(yǎng)的每分鐘閃爍值(CPM)分別為(6.43±0.47)×104、(4.30±0.38)×104、(1.97±0.13)×104和(0.24±0.03)×104,含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的MSC與不同密度的混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的CPM值分別為(7.85±0.07)×104、(5.64±0.12)×104、(3.09±0.18)×104和(1.73±0.05)×104。結(jié)論:無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞均為MSC,有傳代增殖潛能,傳代可達(dá)臨床治療MSC細(xì)胞量,并可避免異種蛋白致敏。

[10]李蘭蘭,馬炬明,陳玲肖.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2013,51(27):85-87.

摘要：目的建立一種簡(jiǎn)單的體外無血清培養(yǎng)擴(kuò)增人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)的方法。方法利用酶消化法分離hUCMSCs,在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)體系下培養(yǎng)擴(kuò)增,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,CCK-8法分析細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原表達(dá)及細(xì)胞周期,進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化。結(jié)果 hUCMSCs呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài),具有較強(qiáng)的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽(yáng)性表達(dá),而CD34、CD45呈陰性表達(dá)。3周可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。結(jié)論利用酶消化法和無血清的培養(yǎng)體系能夠快速分離培養(yǎng)出大量hUCMSCs,該方法擴(kuò)增得到的間充質(zhì)細(xì)胞具備穩(wěn)定的細(xì)胞標(biāo)記物和生長(zhǎng)狀態(tài),可用于各種治療的臨床試驗(yàn)。

[11]周婷婷,衛(wèi)超,陳曉東,李海,汪錚.無血清培養(yǎng)體系原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞[J].中國(guó)組織工程研究,2013,17(27):4980-4987.

摘要：背景: 以含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,存在著進(jìn)一步應(yīng)用的障礙。目的: 建立無血清培養(yǎng)體系原代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。方法: 取臍帶華通氏膠(Wharton’sJelly),采用機(jī)械法將組織膠切碎,1-3mm3大小,分別培養(yǎng)到含胎牛血清*培養(yǎng)液中以及無血清培養(yǎng)液中。培養(yǎng)第11,14,17天收獲細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。在符合2006年制定的干細(xì)胞zui低評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上,以集落形成單元指標(biāo)評(píng)估何種培養(yǎng)體系能獲得較多高質(zhì)量的原代細(xì)胞。結(jié)果與結(jié)論: 無血清培養(yǎng)體系相對(duì)于經(jīng)典的含血清的培養(yǎng)體系而言,細(xì)胞生長(zhǎng)速度更快。另外,培養(yǎng)第11天,集落形成實(shí)驗(yàn)表明無血清培養(yǎng)體系下能獲得更多的集落。因此,無血清培養(yǎng)體系可以保持間充質(zhì)干細(xì)胞的特性,為替代含血清培養(yǎng)體系進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)提供了可能。

[12]王昊旻. 無血清培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的初步探討[A].

[13]李力,龐妍,張航,鄺麗萍,肖芷芳,王耀春,肖揚(yáng).梯度血清遞減體外培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(06):989-993.

摘要：背景:人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增與培養(yǎng)條件密切相關(guān),而含體積分?jǐn)?shù)10%~20%胎牛血清的培養(yǎng)基可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。目的:建立梯度血清遞減擴(kuò)增培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。方法:采用膠原酶Ⅱ消化分離獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液,并通過貼壁培養(yǎng)進(jìn)行純化,細(xì)胞貼壁后采用梯度血清遞減方法,即第1代80%含血清培養(yǎng)基,20%無血清培養(yǎng)基;第2代50%含血清培養(yǎng)基,50%無血清培養(yǎng)基;第3代20%含血清培養(yǎng)基,80%無血清培養(yǎng)基;第4代100%無血清培養(yǎng)基。另一種傳代中始終采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的α-MEM*培養(yǎng)液。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)記,進(jìn)行成骨誘導(dǎo)試驗(yàn),同時(shí)與經(jīng)典的含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)體系進(jìn)行比較。結(jié)果與結(jié)論:梯度血清遞減培養(yǎng)法與經(jīng)典α-MEM培養(yǎng)體系所獲得的細(xì)胞在擴(kuò)增能力、細(xì)胞形態(tài)、免疫表型等方面相似。細(xì)胞在兩種培養(yǎng)體系中均能保持良好的分化潛能。但梯度血清濃度法培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞可使用更少量胎牛血清,提高臨床應(yīng)用安全性。

[14]徐曼. 人臍帶不同組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其免疫調(diào)控能力和支持造血的實(shí)驗(yàn)研究[D].

摘要：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)是來源于發(fā)育早期中胚層的具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞,廣泛存在于全身多種組織中。大量研究證明,MSC具有低免疫原性、多向分化潛能、調(diào)節(jié)免疫以及分離培養(yǎng)操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。MSC的臨床研究已經(jīng)在許多國(guó)家開展,作為種子細(xì)胞,臨床上主要用于治療機(jī)體無法自然修復(fù)的組織細(xì)胞和器官損傷等多種難治性疾病,如脊髓損傷、腦癱、肌萎縮側(cè)索硬化癥、中風(fēng)、糖尿病、糖尿病足、肝硬化等;作為免疫調(diào)節(jié)和造血支持細(xì)胞,用于治療免疫排斥和自身免疫性疾病,如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、克隆氏病等。MSCzui早在骨髓中發(fā)現(xiàn),但骨髓中含量極少,且骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能,并且隨著年齡的增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增分化能力亦顯著降低。近年來,國(guó)內(nèi)外大量研究證明臍帶作為胎兒發(fā)育的一部分,含有大量的多能干細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)擴(kuò)增速度快,且臍帶屬于胚胎外組織,在胎兒娩出后成為“廢棄物”,取材方便,來源豐富,無倫理學(xué)問題,因此,被看作是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的主要替代品,具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。不同學(xué)者分別從整條臍帶、臍帶的基質(zhì)、臍靜脈內(nèi)皮中分離獲得MSC,還有為數(shù)不少的學(xué)者從胎盤羊膜中分離獲得MSC。考慮到臍帶組織構(gòu)成簡(jiǎn)單,包括表皮(羊膜上皮細(xì)胞)、基質(zhì)(Wharton’s jelly)及血管,既無毛細(xì)血管也無淋巴管,但其超微結(jié)構(gòu)、免疫組化和活體功能研究顯示,羊膜下、血管間和血管周圍區(qū)域在細(xì)胞數(shù)量和特性上均有顯著差異,為此,我們擬將這三種組織分開,從中分別分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增MSC,并研究其生物學(xué)特性、免疫調(diào)控能力及造血支持作用,為臨床應(yīng)用提供重要依據(jù)。首先,我們通過機(jī)械分離及膠原酶消化法分別從人臍帶的羊膜(Amnion)、基質(zhì)(Wharton’s jelly)及血管(Vessel)中獲得組織細(xì)胞,通過反復(fù)貼壁純化獲得AM-MSC、WJ-MSC、VS-MSC;從整條臍帶(Umbilical cord)中獲得UC-MSC;通過密度梯度離心法從骨髓(Bone marrow)中分離得到單個(gè)核細(xì)胞,同樣通過反復(fù)貼壁純化獲得BM-MSC。然后,從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、多向分化潛能特性及細(xì)胞免疫表型五個(gè)方面進(jìn)行比較和鑒定。結(jié)果表明,五組MSC具有相似的生物學(xué)特征:1)細(xì)胞培養(yǎng)至第3代細(xì)胞形態(tài)相對(duì)均一,為典型的成纖維樣,呈平行或漩渦狀排列;2)細(xì)胞具有強(qiáng)大的體外擴(kuò)增能力;3)均有80%以上的細(xì)胞處于G0/G1,提示臍帶不同來源的MSC同BM-MSC一樣均具有典型的干細(xì)胞增殖特點(diǎn),即只有少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期;但BM-MSC的培養(yǎng)需添加低濃度的細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF,且培養(yǎng)至5代后擴(kuò)增能力逐漸減低,而臍帶來源的MSC僅在低營(yíng)養(yǎng)條件下即能大量擴(kuò)增,傳代至第14代,細(xì)胞生物學(xué)特性無明顯改變;4)對(duì)其誘導(dǎo)多向分化,結(jié)果表明,細(xì)胞可向成骨、成脂肪和成軟骨方向分化,但與BM-MSC相比臍帶來源的MSC成骨能力略低,臍帶來源的MSC各組間無差異;5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型,結(jié)果表明,臍帶不同組織來源的MSC同BM-MSC類似,均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、HLA-ABC及多能干細(xì)胞標(biāo)志物TRA-1-60,低表達(dá)或不表達(dá)造血及內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志即CD14、CD31、CD34、CD45,以及移植免疫排斥相關(guān)的表面標(biāo)志HLA-DR、CD80、CD86、CD40、CD40L;各組細(xì)胞表型進(jìn)行比較,CD166表達(dá)有顯著差異,CD31、CD106、HLA-DR的表達(dá)具有高度的顯著差異。其次,通過淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)其免疫調(diào)控能力。結(jié)果表明,對(duì)于有絲分裂原及異體抗原誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖各組MSC均有抑制作用,且這種抑制作用具有劑量依賴性,隨MSC的細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,其抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng);實(shí)時(shí)定量PCR和RT-PCR方法檢測(cè)與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10、IL-11和TGF-β1的表達(dá)亦無顯著差別,但UC-MSC組分泌的IL-6與WJ-MSC、VS-MSC、AM-MSC、BM-MSC組相比差異極其顯著(P=0.0000),WJ-MSC與AM-MSC相比也有明顯差別(p=0.008)。zui后,探討臍帶不同組織來源的MSC的造血支持作用。以臍帶不同組織來源的MSC為飼養(yǎng)層,與臍帶血造血干/祖細(xì)胞在無血清培養(yǎng)體系下共培養(yǎng)7天,檢測(cè)有核細(xì)胞、CD34+細(xì)胞和造血集落的擴(kuò)增效率。結(jié)果顯示,MSC可以在體外有效支持造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增,與對(duì)照組相比差異高度顯著;且UC-MSC組的有核細(xì)胞、CD34+細(xì)胞及CFU-C的擴(kuò)增效率均顯著高于WJ-MSC、VS-MSC和AM-MSC組,多能干細(xì)胞集落CFU-Mix的擴(kuò)增效率未見顯著差異;后三者之間進(jìn)行比較,WJ-MSC組和VS-MSC組對(duì)紅系祖細(xì)胞及粒、單核系祖細(xì)胞的擴(kuò)增效率高于AM-MSC組,且經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR和RT-PCR方法檢測(cè)MSC分泌的造血生長(zhǎng)因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量,其差異也支持了這一結(jié)論,其中IL-3、IL-11、HGF、TPO、EPO、VEGF、M-CSF和G-CSF的表達(dá)水平無顯著差異,而UC-MSC組IL-6、SCF、FLT3、LIF的表達(dá)量顯著高于其它各組。上述結(jié)果提示,臍帶不同組織來源的MSC的生物學(xué)特性及免疫調(diào)控作用與骨髓來源的MSC無明顯差異,但在支持造血的功能有所不同,隨著對(duì)MSC研究的不斷深入,其應(yīng)用的范圍將更為廣泛。而作為種子細(xì)胞,不同組織來源的MSC的功能亦有不同,值得我們進(jìn)一步深入探討和研究。

[15]方彥艷,馬健.無血清培養(yǎng)基分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2010,31(05):21-24.

摘要：目的探討應(yīng)用無血清培養(yǎng)體系分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,明確其成骨生物學(xué)特性,為臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法在無血清干細(xì)胞培養(yǎng)體系下,利用組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng),擴(kuò)增臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,在倒置顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,流式細(xì)胞檢測(cè)鑒定其表面標(biāo)記CD34、CD44、CD90及CD45的表達(dá),成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)2～3周后觀察其細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,茜素紅染色鑒定其成骨情況。結(jié)果臍帶組織塊接種后第1次更換培養(yǎng)液12h后,有少量梭形的細(xì)胞從臍帶組織邊緣爬出,培養(yǎng)5～6d左右成單層狀生長(zhǎng),12d左右梭形狀細(xì)胞呈現(xiàn)復(fù)層生長(zhǎng)趨勢(shì),細(xì)胞表面標(biāo)記CD44、CD90均呈陽(yáng)性為間充干細(xì)胞來源,CD34、CD45均呈陰性為非造血干細(xì)胞來源;細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)2～3周后具有良好的分化成骨能力。結(jié)論利用無血清的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)體系,臍帶組織培養(yǎng)法能夠分離培養(yǎng)出大量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,避免了培養(yǎng)中異種蛋白的混入而降低臨床排異反應(yīng)。

[16]田毅. 人臍帶Wharton's jelly間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及其與腦腫瘤干細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[D].鄭州大學(xué),2010.

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